Как ORF и адаптеры используются при строительстве библиотек, основанных на CRISPR?

Технология CRISPR (регулярно межпремительные короткие палиндромные повторения) революционизировала область генотической инженерии, предлагая мощный инструмент для редактирования генома, регуляции генов и исследований функциональной геномики. Конструкция библиотек, основанных на CRISPR, является важным шагом в крупномасштабных генетических экранах, что позволяет исследователям систематически опросить функцию генов по всему геному. В этом блоге мы рассмотрим, как открытые рамки для чтения (ORF) и адаптеры используются при строительстве библиотек, основанных на CRISPR, а также представим наши предложения в качестве поставщика ORF и адаптеров.

Понимание ORF в CRISPR -базирующейся строительстве библиотеки

Открытые рамки считывания (ORF) являются частью последовательности ДНК гена, которые могут быть переведены в белки. В контексте конструкции библиотеки на основе CRISPR ORF играют жизненно важную роль в экранах усиления - функции (GOF). Эти экраны направлены на то, чтобы идентифицировать гены, которые, при избыточной экспрессии, дают определенный фенотип, такие как повышенная пролиферация клеток, устойчивость к препарату или измененная морфология клеток.

Чтобы построить библиотеку GOF на основе CRISPR, ORF сначала выделены из библиотеки кДНК или синтезируют de novo. Затем ORF клонируются в подходящий вектор, часто лентивирусный или ретровирусный вектор, который может эффективно доставить генетический материал в клетки -мишени. Вектор содержит регуляторные элементы, такие как промотор, чтобы стимулировать выражение вставленного ORF.

Процесс клонирования ORF в вектор обычно включает в себя ограничение пищеварения ферментов и лигирование. ORF переваривается конкретными рестрикционными ферментами, которые создают совместимые концы с перевариваемым вектором. Затем два фрагмента ДНК лигируют вместе с использованием ДНК -лигазы, образуя рекомбинантную плазмиду. Эта плазмида может быть дополнительно амплифицирована у бактерий, а затем упакована в вирусные частицы для доставки в клетки.

После того, как ORF - содержащие векторы введены в клетки, ORF транскрибируются и переводятся в белки. Скринируя большое количество клеток, экспрессирующих различные ORF, исследователи могут идентифицировать гены, которые связаны с желаемым фенотипом. Этот подход использовался для обнаружения новых драйверов рака, генов, участвующих в иммунных реакциях, и регуляторах дифференцировки стволовых клеток.

Роль адаптеров в строительстве библиотеки на основе CRISPR

Адаптеры представляют собой короткие последовательности ДНК, которые используются для модификации фрагментов ДНК во время конструкции библиотеки. В контексте библиотек, основанных на CRISPR, адаптеры выполняют несколько важных функций.

1. Адаптеры линкера для клонирования

При клонировании ORF или других фрагментах ДНК в вектор, адаптеры линкера могут использоваться для создания совместимых концов между вставкой и вектором. Например, если ORF и вектор имеют различные рестрикционные ферментные сайты, адаптеры линкера могут быть разработаны так, чтобы иметь один конечный конец с ORF, а другой, совместимый с вектором. Это позволяет эффективно перевязать вставку в вектор, даже если натуральные концы не совместимы.

2. Адаптеры штрих -кода для мультиплексирования

На широкомасштабных экранах CRISPR часто необходимо мультиплексировать множественные образцы или библиотеки. Адаптеры штрих -кода используются для маркировки каждого отдельного фрагмента ДНК или библиотеки уникальной последовательности штрих -кода. Эти штрих -коды позволяют идентификацию и отслеживание каждого образца во время секвенирования и анализа данных. Например, на объединенном экране CRISPR различные популяции клеток или экспериментальные условия могут быть помечены различными штрих -кодами. После секвенирования информация о штрих -коде может использоваться для определения того, какие считывания принадлежат к какой образе, позволяя сравнить различные условия в одном прогоне секвенирования.

3. Адаптеры усиления для ПЦР

ПЦР -амплификация является общим шагом в конструкции библиотеки для увеличения количества ДНК. Адаптеры усиления предназначены для отжига до конца фрагментов ДНК и служат праймерами для ПЦР. Эти адаптеры также могут включать в себя дополнительные элементы, такие как секвенирование сайтов связывания праймера или уникальных молекулярных идентификаторов (UMIS). UMI - это случайные последовательности, которые добавляются в каждую молекулу ДНК во время подготовки библиотеки. Их можно использовать для исправления для смещения амплификации ПЦР и ошибок секвенирования, повышая точность количественного определения и анализа.

Наши предложения в качестве поставщика ORF и адаптеров

Как ведущий поставщик ORF и адаптеров, мы предлагаем широкий спектр продуктов для поддержки CRISPR -конструкции библиотеки. Наши ORF тщательно курируются и проверены для обеспечения высокого качества и полной длины. Мы предлагаем ORF от различных видов, включая человека, мыши и крысы, а также можем предоставлять пользовательские - синтезированные ORF на основе конкретных требований клиентов.

Наши адаптеры разработаны с точностью и доступны в разных форматах для удовлетворения разнообразных потребностей строительства библиотеки. Если вам нужны адаптеры линкеров для клонирования, адаптеры штрих -кода для мультиплексирования или адаптеры усиления для ПЦР, у нас есть подходящее решение для вас.

Мы также предоставляем высокие - качественные ORF и адаптеры с надежной производительностью. Например, нашORFS Union Elbow 90 ° Гидравлический адаптерпредназначен для обеспечения безопасного и утечки - бесплатное соединение в гидравлических системах, что также является метафорой для стабильной и надежной связи в генетических конструкциях. НашРегулируемый адаптер локтя на 90 °предлагает гибкость в установке, аналогичная гибкости, которую мы предоставляем при настройке наших продуктов, чтобы соответствовать различным экспериментальным настройкам. И нашORF Swivel Run Tee гидравлические фитинги и адаптерыизвестны своей плавной работой, так же, как наши ORF и адаптеры обеспечивают плавные и эффективные процессы строительства библиотеки.

Свяжитесь с нами для закупок и сотрудничества

Если вы заинтересованы в наших ORF и адаптерах для ваших строительных проектов в области библиотеки CRISPR, мы приглашаем вас связаться с нами для закупок и сотрудничества. Наша команда экспертов готова помочь вам в выборе подходящих продуктов для ваших конкретных потребностей и обеспечении технической поддержки на протяжении всего процесса исследования. Независимо от того, являетесь ли вы небольшой академической лабораторией или крупной фармацевтической компанией, мы стремимся помочь вам в достижении ваших исследований с высоким качественным продуктом и отличным обслуживанием.

Ссылки

1. Cong, L., Ran, FA, Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N.,… & Zhang, F. (2013). Multilex Genome Engineering с использованием систем CRISPR/CAS. Science, 339 (6121), 819 - 823.
2. Shalem, O., Sanjana, NE, & Zhang, F. (2014). Высокая - функциональная геномика пропускной способности с использованием CRISPR - CAS9. Nature Reviews Genetics, 15 (8), 591 - 603.
3. Wang, T., Wei, JJ, Sabatini, DM, & Lander, ES (2014). Генетические экраны в клетках человека с использованием системы CRISPR - CAS9. Science, 343 (6166), 80 - 84.